Az angol-holland származású színésznő Audrey Kathleen van Heemstra Ruston néven született Belgiumban, Joseph Victor Anthony Ruston és Ella van Heemstra bárónő gyermekeként. Édesapja, később anyai nagymamája után Hepburn-Rustonra módosította a nevét.
Első főszerepe Amerikában Ann hercegnő volt a Római vakációban Gregory Peck oldalán. A filmért megkapta a legjobb női főszerepért járó Oscar-díjat. A szelíd, kislányos, ám minden mozdulatában előkelő származását idéző stílusával sikerült belopnia magát a közönség szívébe. A Római vakáció után sorra kapta a filmszerepeket. Filmpartnerei közé sorolhatjuk még Humphrey Bogartot, Fred Astaire-t, Cary Grantet és Gary Coopert. Saját pályájáról így vélekedett: „A karrierem teljes rejtély számomra. Az első nap óta csak csodálkozom. Sosem hittem volna, hogy valaha színésznő leszek. Soha nem gondoltam volna, hogy filmekben fogok szerepelni. Sohasem gondoltam volna, hogy mindez meg fog velem történni.”
1988-ban az ENSZ Gyermeksegélyezési Alapjának (UNICEF) jószolgálati nagykövete lett, élettársával és John Isaac fényképésszel jártak Etiópiában, Szudánban, Szomáliában, Salvadorban, Hondurasban, Mexikóban, Venezuelában, Ecuadorban, Bangladesben, Vietnamban, Thaiföldön. 1992-ben Szabadság Elnöki Emlékérmet kapott a tevékenységéért.
1993-ban halt meg vastagbélrákban a Genfi-tó melletti házában. 1994-ben két fia, Sean és Luca megalapította az Audrey Hepburn Gyermekalapítványt.
1999-ben az életét filmre vitték The Audrey Hepburn Story címmel. A főszerepet Jennifer Love Hewitt játszotta. 2006-ban a brit „New Woman“ magazin olvasói a világ legszebb nőjének választották.
